Luận văn Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích các hoạt chất chính trong cây hương thảo (rosmarinus officinalis l.) bằng phương pháp HPLC

Nội dung tài liệu: Luận văn Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích các hoạt chất chính trong cây hương thảo (rosmarinus officinalis l.) bằng phương pháp HPLC

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ OANH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG CÂY HƯƠNG THẢO (ROSMARINUS OFFICINALIS L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2020
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ OANH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG CÂY HƯƠNG THẢO (ROSMARINUS OFFICINALIS L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440112.03 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS. TS. Tạ Thị Thảo 2. TS. Lê Thị Huyền Hà Nội - 2020
3. LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất tới PGS. TS. Tạ Thị Thảo và TS. Lê Thị Huyền - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả các thầy cô trong bộ môn hoá phân tích và các cán bộ phòng đào tạo sau đại học của trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa Sinh biển đã quan tâm giúp đỡ, với những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, tháng 10 năm 2020 Học viên Lê Thị Oanh
4. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỤC LỤC ................................................................................................................... i MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2 1.1. Giới thiệu về họ Hoa môi (Lamiaceae) 2 1.2. Chi Rosmarinus 2 1.3. Loài Hương thảo (R. officinalis L.) 3 1.3.1. Đặc điểm thực vật ..................................................................................... 3 1.3.2. Nguồn gốc phân bố ................................................................................... 4 1.3.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học ........................................... 4 1.3.4. Công dụng và hoạt tính sinh học loài R. officinalis .................................. 9 1.4. Tổng quan về các phương pháp phân tích thành phần hóa học của loài R. officinalis 11 1.4.1. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của dược liệu .............. 11 1.4.2. Các nghiên cứu về xác định thành phần hóa học trong loài R. officinalis .12 1.4.3. Các phương pháp chiết tách chất phân tích ra khỏi mẫu dược liệu ........ 14 CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM ............................................................................. 16 2.1. Đối tượng nghiên cứu 16 2.2. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị 16 2.2.1. Chất chuẩn ............................................................................................... 16 2.2.2. Các hoá chất khác .................................................................................... 17 2.2.3. Dụng cụ, thiết bị ...................................................................................... 18 2.3. Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Phương pháp phân tách các dịch chiết và phân lập các hợp chất ........... 18 2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc các chất ................................................. 21 2.3.3. Tối ưu hóa điều kiện hệ thống sắc ký ..................................................... 21 2.3.4. Phương pháp xử lý mẫu .......................................................................... 22 2.4. Đánh giá phương pháp phân tích 25 2.4.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký......................................................... 25 i
5. 2.4.2. Tính chọn lọc, tính đặc hiệu .................................................................... 25 2.4.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ........................................................ 26 2.4.4. Độ lặp lại của phương pháp .................................................................... 26 2.4.5. Độ đúng (đánh giá qua độ thu hồi).......................................................... 27 2.5. Phân tích mẫu thực tế 28 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 29 3.1. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập được 29 3.2. Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện đo của hệ thống sắc ký 33 3.2.1. Khảo sát lựa chọn điều kiện tách trên hệ sắc ký HPLC .......................... 33 3.2.2. Xây dựng các phương trình đường chuẩn ............................................... 37 3.3. Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu dược liệu R. officinalis 42 3.3.1. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết .................................................................. 42 3.3.2. Khảo sát phương pháp chiết .................................................................... 43 3.4. Đánh giá phương pháp phân tích 46 3.4.1. Đánh giá tính phù hợp của hệ thống sắc ký ............................................ 46 3.4.2. Độ đặc hiệu.............................................................................................. 47 3.4.3. Độ lặp lại của phương pháp .................................................................... 48 3.4.4. Độ đúng của phương pháp ...................................................................... 49 3.5. Định lượng bốn hoạt chất chính trên mẫu thực 51 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 55 PHỤ LỤC ii
6. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải 13C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic Phổ cộng hưởng t hạt nhân carbon resonance spectroscopy 13 1H-NMR Proton nuclear magnetic Phổ cộng hưởng t hạt nhân proton resonance spectroscopy ACN Acetonitrile Acetonitrile CDL Limit of detection of calibration Giới hạn phát hiện của đường chuẩn CDQ Limit of quantitation of Giới hạn định lượng của đường calibration chuẩn DAD Diod Array Detector Detector mảng diod EtOH Ethanol Ethanol EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetate HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography MeOH Methanol Methanol R2 Correlation coefficient Hệ số tương quan RO1 7α-methoxyrosmanol 7α-methoxyrosmanol RO2 Carnosol Carnosol RO3 Demethylsalvicanol Demethylsalvicanol RO4 Rosmarinoside A Rosmarinoside A RO5 Sageone Sageone RO6 20-deoxocarnosol 20-deoxocarnosol RO7 11,12,20-trihydroxy-abieta- 11,12,20-trihydroxy-abieta-8,11,13- 8,11,13-triene triene RO8 Rosmanol Rosmanol RO9 7 -methoxyrosmanol 7 -methoxyrosmanol RO10 7α-ethoxyrosmanol 7α-ethoxyrosmanol RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SKĐ Sắc ký đồ v/v Volume/volume Thể tích/thể tích iii
7. DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2. 1. Các mẫu R. officinalis dùng trong nghiên cứu .............................................................. 16 Bảng 3. 1. Số liệu phổ NMR của hợp chất RO1 và hợp chất tham khảo ..................................... 30 Bảng 3. 2. Các hợp chất RO1-RO5 phân lập t loài R. officinalis ................................................ 31 Bảng 3. 3. Các hợp chất RO6-RO10 phân lập t loài R. officinalis .............................................. 32 Bảng 3. 4. Hệ gradient với pha động MeOH/H2O và ACN/ H2O. ............................................... 35 Bảng 3. 5. Thông số đánh giá pic các chất định phân trong các điều kiện rửa giải ..................... 35 Bảng 3. 6. Ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cột đến thông số pic các chất ........................ 36 Bảng 3. 7. Hệ gradient chạy HPLC ................................................................................................... 37 Bảng 3. 8. Khoảng tuyến tính RO1, RO3, RO9, RO10 ................................................................. 38 Bảng 3. 9. Giá trị hệ số b’ .................................................................................................................... 40 Bảng 3. 10. Các đại lượng thống kê ................................................................................................... 40 Bảng 3. 11. Phương trình đường chuẩn của các chất ...................................................................... 41 Bảng 3. 12. CDL và CDQ của RO1, RO3, RO9 và RO10 bằng HPLC-DAD .......................... 41 Bảng 3. 13. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống .............................................................. 46 Bảng 3. 14. Thời gian lưu mẫu đối chiếu và mẫu thử ..................................................................... 48 Bảng 3. 15. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu RO1 .................................. 49 Bảng 3. 16. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu thực ................................... 49 Bảng 3. 17. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp ............................................................... 50 Bảng 3. 18. Kết quả định lượng bốn hoạt chất trong một số mẫu lá và thân R. officinalis ........ 52 iv
8. DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1. 1. Cây Bạc hà (Mentha arvensis) ........................................................................................... 2 Hình 1. 2. Cây Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis) ........................................................................ 2 Hình 1. 3. Loài Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) .................................................................. 3 Hình 1. 4. Cấu trúc của một số terpene phân lập t loài R. officinalis............................................. 6 Hình 1. 5. Cấu trúc của một số flavonoid phân lập t loài R. officinalis ......................................... 8 Hình 1. 6. Cấu trúc của một số phenolic phân lập t loài R. officinalis .......................................... 8 Hình 2. 1. Sơ đồ phân lập các hợp chất t loài R. officinalis................................... 20 Hình 3. 1. Công thức cấu tạo chất RO1 .. 29 Hình 3. 2. Khảo sát bước sóng phát hiện tối ưu của các chất ......................................................... 33 Hình 3. 3. Sắc ký đồ ứng với điều kiện sắc ký lựa chọn được ....................................................... 37 Hình 3. 4. Đường chuẩn các chất RO1, RO3 ................................................................................... 38 Hình 3. 5. Đường chuẩn các chất RO9, RO10 ................................................................................. 39 Hình 3. 6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng RO1, RO3, RO9 và RO10 ...................................................................................................................................................... 42 Hình 3. 7. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ chiết siêu âm đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10 ................................................................................................................................. 43 Hình 3. 8. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian chiết siêu âm đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10 ................................................................................................................................. 44 Hình 3. 9. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dung môi chiết/khối lượng dược liệu đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10 ..................................................................................... 45 Hình 3. 10. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian chiết hồi lưu đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10 ................................................................................................................................. 46 Hình 3. 11. SKĐ của chất đối chiếu RO1, RO3, RO9, RO10 ....................................................... 47 Hình 3. 12. SKĐ của mẫu thử ............................................................................................................ 48 v
9. MỞ ĐẦU Việt Nam là một nước nằm trong vùng nhiệt đới ẩm gió mùa nên có nguồn dược liệu rất phong phú và đa dạng. Nhân dân ta t lâu đã biết dùng cây cỏ để chữa bệnh và phòng bệnh, nhưng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian tùy theo t ng địa phương. Phần lớn các cây thuốc Việt Nam chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, nhất là về thành phần hóa học, tác dụng sinh học và hàm lượng các hoạt chất do đó chưa có được các cơ sở khoa học để tạo được các sản phẩm ứng dụng mới trong các lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm và nông nghiệp. Trong số đó có cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) là một loại cây có nhiều ứng dụng trong cuộc sống. Nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng nó có các khả năng như chống oxi hóa, kháng viêm và chống ung thư, ức chế mạnh sự tăng trưởng tế bào trong tất cả các dòng tế bào ung thư thử nghiệm, có tác dụng hạ đường huyết, kích thích hệ thần kinh.... Với mong muốn tìm hiểu về chất lượng cây Hương thảo, chúng tôi lựa chọn đề tài: ―Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích các hoạt chất chính trong cây Hƣơng thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng phƣơng pháp HPLC‖. Mục tiêu nghiên cứu: - Phân lập được một số hoạt chất chính trong cây Hương thảo dùng làm chất đối chiếu trong việc định tính, định lượng các hoạt chất đó. - Xây dựng được quy trình định lượng các hoạt chất chính trong cây Hương thảo bằng phương pháp HPLC. - Ứng dụng xác định, đánh giá hàm lượng các hoạt chất chính trong một số mẫu Hương thảo ở các vùng khác nhau. 1
10. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về họ Hoa môi (Lamiaceae) Họ Hoa môi (Lamiaceae) còn được gọi bằng nhiều tên khác như họ Húng, họ Bạc hà là một họ thực vật có hoa [32]. Chúng phân bố rộng khắp trên toàn cầu nhưng tập trung chủ yếu ở Địa Trung Hải. Một số loài là cây bụi hay cây gỗ, hiếm gặp hơn là các dạng dây leo. Chúng có lá đối xứng và xếp chồng chéo hình chữ thập hay mọc vòng, thân cây thường hình vuông, có nhiều lông tuyến, nơi giải phóng những hợp chất thơm mà ta ngửi thấy. Các loài thực vật trong họ này nói chung có hương thơm trong mọi phần của cây và nhiều loại cây thân thảo được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực và dùng làm thuốc như: Húng quế, Bạc hà (hình 1.1), Hoàng cầm (hình 1.2) Hương thảo (hình 1.3), Xô thơm, Tía tô... Bên cạnh những loài lấy lá để ăn, làm gia vị còn một số loài được trồng làm cảnh như húng chanh. Một số loài khác được trồng vì mục đích lấy hạt (chứ không phải lá) làm thực phẩm như hạt cây chia [32]. Trên thế giới, Lamiaceae có khoảng 245 chi và 7886 loài khác nhau. Ở Việt Nam có trên 40 chi và khoảng 145 loài. Chi Rosmarinus có khoảng 40 loài, chi Thymus có khoảng 350 loài và hầu hết chúng sống ở Châu Á. Có khoảng 150 loài điển hình của chi Ocimum được biết đến sinh sống ở Ấn Độ, còn ở Châu Âu có 15- 20 loài, Có hơn 100 loài thuộc chi Phlonis, 40-50 loài thuộc chi Lamuim,...[30, 31]. Hình 1. 1. Cây Bạc hà Hình 1. 2. Cây Hoàng cầm (Mentha arvensis) (Scutellaria baicalensis) 1.2. Chi Rosmarinus Rosmarinus là một chi trong họ hoa môi Lamiaceae, nhóm thực vật có hoa. Là loại cây bụi sống lâu năm có bộ lá thơm và hoa màu xanh tím. 2